Ученые из Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Института биологии гена РАН (ЦВРГТБ ИБГ РАН) совместно с коллегами из НИИ пушного звероводства и кролиководства имени Афанасьева впервые в России получили кролика с отредактированным геномом. Родившийся крольчонок оказался самкой, она получила имя Родная.
Первые трансгенные кролики, то есть кролики, в геном которых случайным образом был встроен один из генов человека, были получены еще в 1985 году. Содержащая ген плазмида вводилась в пронуклеус (предшественник ядра оплодотворенной яйцеклетки) путем микроинъекции. Данный метод не позволяет вводить ген в строго определенное место генома. К тому же оказалось, что доступные методы работают с кроликами хуже, чем с лабораторными мышами. В частности, эффективность переноса ядер соматических клеток оказалась очень низкой, первого кролика с нокаутом одного из генов этим методом удалось получить лишь в 2015 году.
Модификация генома животных в строго определенном месте значительно упростилась только с появлением систем редактирования генома, таких как система CRISPR/Cas9, и первые кролики, отредактированные с помощью этой системы, увидели свет лишь относительно недавно. В отличие от генно-модифицированных животных, в ДНК которых вносится ген, не принадлежащий их виду, в данном случае чужеродная ДНК не используется, а заданным образом редактируется собственный геном животного. Полученные таким образом животные не попадают под законодательные ограничения, касающиеся генетически модифицированных организмов, поэтому для их практического использования значительно меньше препятствий.
Впервые технологии редактирования генома были применены к кроликам в 2011 году, когда ученые применили метод «цинковых пальцев»: для разрезания и сшивания ДНК используется фермент, в составе которого есть белковые комплексы с ионами цинка. Вскоре была применена еще одна технология редактирования генома — TALEN. Наиболее популярный в наши дни метод CRISPR/Cas9 был применен к кроликам в 2014 году. В России до настоящего времени подобных успешных работ на кроликах не проводилось.
«Используемые нами технологии напоминают процедуру ЭКО у человека за тем исключением, что в финале мы переносим эмбрионы не той самке, у которой их забирали, а суррогатной матери. В нашем же случае мы дополнительно инъецируем в яйцеклетку компоненты системы CRISPR/Cas9 и лишь затем пересаживаем ее суррогатной матери, — объясняет один из авторов работы, кандидат биологических наук, эмбриолог Юлия Силаева. — В результате с третьей попытки нам удалось осуществить успешный перенос яйцеклеток суррогатной матери и получить от нее потомство, в том числе крольчонка с модифицированным геномом».
Ветеринарный врач ИБГ РАН Полина Сафонова с новорожденным крольчонком
«Мы нокаутировали один из генов (название которого мы не хотели бы раскрывать до опубликования результатов работ), участвующих в метаболизме жиров, нарушение функции которого приводит к ускоренному набору веса, — добавляет один из авторов работы, заведующий лабораторией геномного редактирования эукариот ЦВРГТБ ИБГ РАН, кандидат биологических наук Михаил Шепелев. — Для этого мы направили нуклеазу Cas9 в заданное место генома кролика, где она внесла делецию, которая нарушает нормальную кодирующую последовательность гена. В результате такой делеции у животного не будет образовываться функциональный белок, соответственно, это и есть нокаут гена».
Полученные животные могут быть использованы как модель для биомедицинских исследований, в частности, как модель заболеваний человека, вызванных нарушением жирового обмена. В свою очередь ученые из НИИ пушного звероводства и кролиководства заинтересованы в получении кроликов с улучшенными хозяйственно-экономическими показателями, и так как нокаут этого гена повышает вес кролика, то это может иметь существенную экономическую целесообразность. Крольчиха Родная стала первым в мире кроликом с нокаутом конкретно данного гена, ранее этот ген отключали только у лабораторных мышей и крыс.
Родная на весах
Несмотря на то что это очень важный результат, впереди еще много работы. «Нам нужно оценить влияние нокаута на метаболизм, физиологию и репродукцию животных, так как известно, что при нокауте этого гена может страдать фертильность животных», — уточняет Юлия Силаева.
«Наша лаборатория специализируется на трансгенных животных. В первую очередь, конечно, речь о мышах, важном инструменте для фундаментальной науки. Технологии, которыми мы располагаем, позволяют получать мышей, у которых определенные гены могут выключаться или, наоборот, активироваться в выбранных тканях и органах в нужный момент. Такие мыши очень нужны для экспериментов, в которых мы выясняем, как работают соответствующие белки, для чего они нужны, с кем взаимодействуют, какие последствия будет иметь их отсутствие. Кроме того, можно воспроизводить у мышей мутации, обнаруженные у пациентов, — чтобы разобраться, как именно мутация приводит к болезни, какие молекулярные механизмы за этим стоят. Получение мышей с отредактированным геномом — довольно сложная технически задача: манипуляции проводятся на уровне эмбрионов, для этого нужны опытные квалифицированные специалисты, а также дорогое уникальное оборудование. И хотя сначала в нашей лаборатории занимались преимущественно мышами, было понятно, что при необходимости мы сможем расширить репертуар. Хотя, разумеется, чем крупнее представители вида, чем меньше у них детенышей в помете, чем дольше длится у них беременность, тем работа становится сложнее, дороже и ответственнее, хотя принципы те же самые. Другое важное отличие заключается в том, что трансгенных мышей обычно получают для фундаментальных научных исследований, а сельскохозяйственных животных — для улучшения свойств пород, для устойчивости к болезням или для того, чтобы они вырабатывали какие-нибудь полезные в хозяйстве белки, например в молоко. В прошлом году, например, нам удалось в сотрудничестве с Уральским федеральным аграрным научно-исследовательским центром получить отредактированные эмбрионы коров. В планах, кроме продолжения работы с кроликами, также работа с норками», — рассказывает сотрудник лаборатории, кандидат биологических наук Александра Брутер.
Редактирование генома кроликов будет востребовано и в медицинских исследованиях. Последовательности генов кроликов ближе к генам человека, чем гены мышей. Также более похожи на человеческие ранние стадии эмбриогенеза кролика. Кроликов можно использовать для изучения заболеваний легких, глазных болезней, аллергических реакций, сердечно-сосудистых заболеваний, развития опухолей, инфекционных заболеваний, липидного обмена, атеросклероза, остеопороза. Во многих случаях кролики оказываются более корректной моделью заболевания людей, чем мыши.